Cristallizzazione delle grandi proteine di membrana

Le proteine incorporate nelle membrane sono essenziali per le cellule e per tutte le forme di vita. Non solo ne esistono diverse, ma hanno anche un'ampia gamma di funzioni, dalla comunicazione tra le cellule al trasporto di sostanze all'interno o all'esterno della cellula e alla mediazione di una risposta immunitaria. Le proteine di membrana sono considerate importanti bersagli terapeutici e diagnostici. Se si conoscono la loro struttura e le loro funzioni, la ricerca farmaceutica può sviluppare sostanze attive che influenzano in modo specifico le loro funzioni.

Finora, tuttavia, chiarire la struttura delle proteine di membrana è stato molto difficile. Questo perché i ricercatori devono prima isolare un gran numero di queste molecole e formarne dei cristalli, e proprio qui sta la difficoltà: le proteine di membrana non sono solubili in acqua e spesso sono troppo grandi ed eterogenee per essere cristallizzate con i metodi convenzionali.

Il gruppo guidato da Raffaele Mezzenga, professore di Alimenti e materiali morbidi all'ETH di Zurigo, ha ora superato questa limitazione. In una pubblicazione sulla rivista Nature Communications, il gruppo presenta un metodo generale che può essere utilizzato per cristallizzare proteine di membrana di qualsiasi tipo e dimensione.

Miscela di lipidi e acqua come camera di reazione

I ricercatori hanno gettato le basi di questo metodo negli anni '90 con una procedura nota come "cristallizzazione in meso": Le proteine vengono isolate e arricchite utilizzando miscele stabili di acqua e lipidi, note come mesofasi lipidiche. In queste mesofasi si forma una rete tridimensionale auto-organizzata di tubi d'acqua curvi, le cui pareti sono costituite da lipidi, come in una biomembrana. Questi tubi hanno un diametro di tre o quattro nanometri. Il motivo cubico di base della rete si ripete a intervalli regolari.

In questi tubi, le proteine di membrana si incastrano nella parete con la parte idrorepellente, che altrimenti si trova nella membrana cellulare. Il resto della proteina viene a trovarsi all'interno del tubo pieno d'acqua. Una volta che le proteine si sono allineate correttamente, iniziano a cristallizzare. Proprio perché le provette offrono così poco spazio, finora era possibile cristallizzare solo piccole proteine di membrana. Quelle grandi venivano schiacciate e non formavano cristalli.

Tubi in espansione con lipidi carichi

I ricercatori dell'ETH hanno ora utilizzato un trucco per espandere i tubi: hanno aggiunto ai lipidi una piccola percentuale di lipidi caricati elettricamente. Questi si respingono a vicenda e quindi espandono i tubi. In questo modo il loro diametro è aumentato fino a 20 nanometri. I primi tentativi dei ricercatori di espandere elettrostaticamente i canali d'acqua nelle mesofasi lipidiche risalgono al 2000. Tuttavia, Mezzenga e il suo team sono i primi a dimostrare un metodo di validità generale.

Grazie a queste mesofasi lipidiche rigonfie, i ricercatori dell'ETH sono stati in grado di cristallizzare grandi proteine di membrana e successivamente di chiarirne la struttura. Uno degli oggetti di formazione dei ricercatori dell'ETH è stata la proteina di membrana GLIC (Gloeobacter ligand-gated ion channel) proveniente dai batteri.

Il GLIC ha diverse grandi subunità che si trovano all'esterno della membrana batterica, nella parte esterna della cellula. Questo complesso era stato cristallizzato in precedenza con un metodo diverso perché le sue subunità erano troppo grandi. "Il nostro approccio non solo ha migliorato la cristallizzazione, ma i cristalli erano anche estremamente compatti e appartengono a un nuovo gruppo cristallografico di questa proteina", sottolinea Mezzenga. I ricercatori sono anche riusciti a cristallizzare per la prima volta questa proteina canale nella sua configurazione chiusa. In precedenza, altri ricercatori erano riusciti a cristallizzare questo complesso molecolare solo in apertura, utilizzando un metodo alternativo.

Previsto un impulso per l'elucidazione della struttura

Il nuovo metodo generale "in meso" sarà probabilmente di particolare interesse per i biologi strutturali, che finora hanno faticato a delucidare le grandi proteine di membrana. "Questo strumento darà nuovo impulso all'elucidazione strutturale perché aprirà la strada a proteine che prima erano fuori portata", afferma Mezzenga.

Oggi si conosce la struttura esatta solo di 360 piccole proteine di membrana, che corrispondono a circa un settimo di tutte le proteine di membrana. La struttura della gran parte restante delle proteine di membrana è sconosciuta.

Secondo Mezzenga, anche l'industria farmaceutica dovrebbe trarne vantaggio. "L'elucidazione della struttura è di fondamentale importanza per lo sviluppo di nuovi farmaci", afferma Mezzenga. "Il nostro metodo semplificherà notevolmente questo processo e gli darà una spinta".

Il successo di un lungo progetto

Non c'è alcun brevetto sullo sviluppo. "Abbiamo deliberatamente pubblicato il lavoro in una rivista ad accesso aperto in modo che tutti i ricercatori interessati possano accedervi senza restrizioni", sottolinea Mezzenga, che ha investito oltre tre anni in questo progetto. Ha iniziato i primi esperimenti nel 2015 e ci ha lavorato durante il suo anno sabbatico alla RMIT University di Melbourne nel 2016. Ha condotto ulteriori esperimenti, come l'elucidazione strutturale del GLIC, presso la sorgente di luce di sincrotrone dell'Istituto Paul Scherrer (PSI). Il progetto è stato finanziato in parte da una borsa di studio della Fondazione Nazionale Svizzera per la Scienza.