Rilevare i cambiamenti funzionali a livello del proteoma

Le proteine sono onnipresenti nelle cellule biologiche. Sono i mattoni della vita e svolgono innumerevoli funzioni importanti. In ogni momento, in una cellula umana sono presenti migliaia di proteine diverse e spesso centinaia o migliaia di copie di ogni tipo di proteina sono presenti contemporaneamente.

Negli ultimi anni, i ricercatori sono riusciti a catturare completamente questa enorme diversità con dispositivi di misurazione. Oggi è possibile analizzare letteralmente l'intero proteoma, cioè tutte le specie proteiche e le loro quantità, in cellule, organi o addirittura organismi in una sola volta. Questi approcci classici alla proteomica possono essere utilizzati anche per determinare come si sviluppano le quantità di ogni singola specie proteica al variare delle condizioni ambientali.

Molti eventi molecolari sfuggono

Ma c'è qualcosa che i classici screening del proteoma non sono riusciti a cogliere: i numerosi eventi molecolari che si verificano contemporaneamente nelle cellule e che portano a cambiamenti funzionali nelle proteine.

Questi eventi includono modifiche chimiche alle proteine stesse, come la fosforilazione, nonché interazioni con altre proteine o altre molecole. Questi eventi molecolari sono importanti: molti processi nelle cellule, come le cascate di segnalazione, sono spesso basati esclusivamente su diversi eventi molecolari e non su aggiustamenti nelle quantità di proteine. Ciò significa che una cellula con lo stesso insieme di molecole proteiche può adattarsi molto rapidamente a nuove circostanze senza doverne produrre di nuove.

I cambiamenti funzionali diventano misurabili

I ricercatori guidati da Paola Picotti, professoressa di biologia dei sistemi molecolari presso l'ETH di Zurigo, hanno quindi ipotizzato di poter leggere i cambiamenti strutturali per un'ampia varietà di eventi molecolari che portano a cambiamenti funzionali nelle proteine.

I biologi dei sistemi hanno sviluppato ulteriormente un approccio esistente per la registrazione dei proteomi, al fine di essere in grado di rilevare tali cambiamenti funzionali nelle proteine in modo dettagliato allo stesso tempo.

Ora ci sono riusciti, come hanno recentemente riportato sulla rivista "Cell". Con il nuovo approccio, i ricercatori sono ora in grado di analizzare molte attività enzimatiche, interazioni molecolari e cambiamenti chimici. in situ,misurare direttamente nei fluidi cellulari.

Copertura massicciamente aumentata

Come proxy degli eventi molecolari, i ricercatori misurano le strutture proteiche presenti in un campione. Allo stesso tempo, misurano anche le loro quantità. "In questo modo, catturiamo la maggior parte degli eventi che influenzano la funzione delle proteine. Questo aumenta drasticamente la copertura", sottolinea Picotti.

L'ETH ha gettato le basi del nuovo metodo alcuni anni fa. Utilizzando una tecnica chiamata spettrometria di massa a proteolisi limitata (LiP-MS), lei e i suoi collaboratori sono riusciti a misurare con relativa facilità la maggior parte delle proteine presenti in un campione biologico, come la linfa cellulare di cellule di lievito o i fluidi corporei provenienti da biopsie. ? stata anche in grado di rilevare diverse strutture di una stessa proteina.

Le proteine possono essere utilizzate meglio come biomarcatori

Per testare il nuovo approccio LiP-MS, Picotti e i suoi collaboratori hanno esaminato tre sistemi ben noti. Hanno scoperto che il metodo non solo consente di registrare tutti i cambiamenti funzionali noti, ma anche di scoprire eventi precedentemente sconosciuti. "Ciò significa che ora possiamo rilevare un numero molto più elevato di processi biologici alterati rispetto alla sola misurazione dell'abbondanza delle proteine", afferma Picotti. Si tratta di un passo importante per rendere le proteine, le loro strutture e funzioni alterate più utilizzabili come validi biomarcatori in futuro".

I ricercatori hanno testato il loro concetto su cellule di lievito esponendole a uno stress salino. Dopo poco tempo, le cellule hanno attivato una speciale via di segnalazione per far fronte all'aumento della concentrazione di sale nel loro ambiente. Quando questa via di segnalazione viene attivata, i fosfati si "attaccano" ad alcune proteine, con la cosiddetta fosforilazione, altre interagiscono con altre molecole e alcune cambiano la loro attività. Di conseguenza, gli enzimi cambiano la loro struttura e quindi anche la loro funzione.

I ricercatori dell'ETH hanno scoperto che dei 3.500 tipi diversi di proteine presenti nel lievito, Chi siamo ha cambiato forma in questo esperimento. La frequenza di solo 30 di queste è cambiata. "Questo significa che le cellule non producono un numero particolarmente elevato di proteine in risposta a nuovi stimoli di breve durata o a uno stress acuto, ma che rimodellano le proteine esistenti e ne modificano le funzioni".

Una volta superato lo stress, le molecole rimodellate possono essere riportate al loro stato originale. Di conseguenza, il numero di proteine nelle cellule rimane abbastanza costante nel tempo. Questo è un vantaggio per la cellula: produrre nuove molecole richiede molto tempo ed energia. Il rimodellamento, invece, avviene in pochi secondi e richiede poca energia.

Uno strumento diagnostico promettente

In un progetto, Picotti ha già testato il metodo su una malattia umana. Lei e i suoi collaboratori hanno confrontato diverse centinaia di campioni di pazienti affetti da Parkinson con quelli di persone sane per trovare biomarcatori strutturali della malattia.

Conclusione preliminare: "La quantità di proteine da sola non è utile dal punto di vista diagnostico in questo caso", afferma Picotti. La maggior parte delle proteine era più o meno ugualmente abbondante sia nelle persone sane che in quelle malate. Tuttavia, quando i ricercatori hanno cercato strutture diverse di una stessa proteina, le cose sono apparse più promettenti. Un gran numero di proteine ha mostrato strutture alterate nei campioni dei pazienti. Ciò rende l'approccio un promettente strumento diagnostico. Tuttavia, la possibilità di utilizzarlo anche per la diagnosi precoce deve ancora essere studiata.

L'ETH offre il metodo a livello commerciale

I ricercatori hanno già brevettato l'approccio. L'ETH spin-off Biognosys, specializzato in proteomica, ha ottenuto la licenza del metodo e lo sta offrendo con successo a livello commerciale per analizzare i campioni alla ricerca di cambiamenti nella struttura delle proteine per lo sviluppo di farmaci. Il nuovo approccio ha riscosso grande interesse anche nel mondo accademico. "Ricevo diverse richieste alla settimana da ricercatori esterni che mi chiedono se il mio laboratorio può analizzare dei campioni per loro. Tuttavia, non possiamo soddisfare tutte queste richieste perché non abbiamo la capacità necessaria", spiega Picotti.